میتوسیب

کیت سنجش تکثیر و زنده‌مانی سلول به روش MTT

MTT از ساده‌ترین و ارزانترین روش‌های سنجش تکثیر و قابلیت حیات سلول است. این خصوصیات MTT را به روشی پرکاربرد و متداول برای بررسی توان القا یا مهار تکثیر انواع داروها، سایتوکاین‌ها، فاکتورهای رشد، میتوژن‌ها و سایر تیمارها تبدیل کرده است. کیت میتوسیب حاوی محلول یا پودر MTT و DMSO است که در سه حجم برای انجام تست در ۱، ۳ و ۱۰ پلیت ۹۶ خانه تهیه شده است. لطفا اطلاعات هریک را در قسمت «کد محصول محتویات و قیمت» ملاحظه بفرمایید. طول عمر مفید محصول ۱ سال است.

کد محصول، محتویات و قیمت
کد محصول محتویات تعداد تست قیمت (تومان)
۳۲۰۲-۱۰۰ محلول MTT (۱ml محلول ۵mg/ml)
(۱۰ml) DMSO
۱۰۰ تست
۱ پلیت ۹۶ خانه
۱۲۰/۰۰۰
۳۲۰۲-۳۰۰ محلول MTT (۳ml محلول ۵mg/ml)
(۳۰ml) DMSO
۳۰۰ تست
۳ پلیت ۹۶ خانه
۳۵۰/۰۰۰
۳۲۰۲-۶۰۰ پودر MTT ( ۱ ویال ۶۰mg)
(۶۰ml) DMSO
بافر PBS استریل (۳۰ml)
۶۰۰ تست
۶ پلیت ۹۶ خانه
۵۱۷/۰۰۰
شیوه نگهداری

ارسال محصول در دمای ۴ تا ۱۵ درجه سانتیگراد انجام می‌شود.

DMSO را در دمای محیط نگهداری کنید. محلول MTT‌ را تا زمان استفاده در فریزر قرار دهید. پودر MTT را در یخچال نگهداری کنید.

خلاصه دستورالعمل استفاده از کیت

مشروح دستور‌العمل را در اینجا بخوانید. پروتکل کیت به شرح زیر خلاصه شده است:
۱- بسته به سلول و نوع پژوهش خود تعداد مناسبی سلول را در چاهک‌های پلیت ۹۶ خانه بریزید و پلیت را ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در انکوباتور (۵٪ CO2) گرماگذاری کنید.

۲- محیط کشت موجود را با محیط حاوی تیمارهای مورد نظر جایگزین کنید و به مدت ۲۴ تا ۷۲ ساعت گرماگذاری کنید (بسته به پژوهش خود). بهتر است علاوه بر سلول‌های تحت تیمار، سلول‌های تیمار نشده و چاهک فاقد سلول هم به عنوان کنترل داشته باشید.

۳- محلول MTT را از فریزر خارج کنید و اجازه دهید به دمای محیط برسد. ۱۰μl محلول ۵mg/ml به هر چاهک اضافه کنید . پلیت‌ها را ۴ تا ۶ ساعت در انکوباتور قرار دهید.

۴- مایع رویی را به آرامی و به طور کامل تخلیه کنید و ۱۰۰μl از DMSO داخل هر چاهک بریزید.

نکات کلیدی

سلول‌های با رشد چسبیده:
* برای تعیین درصد پرشدگی (confluency) مناسب و تعیین تعداد سلول‌های مورد نیاز برای شروع تست، مدت زمان کل فرآیند و سرعت رشد سلول‌ها را در نظر بگیرید تا مرگ سلولی بر اثر پرشدن بیش از حد چاهک‌ها (به خصوص چاهک‌های کنترل) در انتهای فرآیند در نتیجه تست شما خطا ایجاد نکند.

*درصورتی که درصد پرشدگی مناسب تعیین شده باشد با یک رابطه ساده می‌توان تخمین زد به چند فلاسک با چه میزان پرشدگی برای شروع تست نیاز است. مساحت هر چاهک از پلیت ۹۶ خانه به طور استاندارد برابر ۰/۳۲cm2 است. و مساحت فلاسک T75 همانطور که از نام آن پیداست ۷۵cm2 است. اگر شما به ۹۶ چاهک به پرشدگی ۷۰٪ نیاز داشته باشید. باید حداقل سطحی معادل ۳۰/۷۲cm2 پوشیده از سلول با پرشدگی ۷۰٪ (۹۶×۰/۳۲= ۳۰/۷۲) در اختیار داشته باشید. اگر محتویات یک پلیت T75 را تریپسینه کرده‌اید و تمام آن را در ۱ میلی لیتر محیط تعلیق کرده‌اید باید ۴۱۰ میکرولیتر (۳۰/۷۲ تقسیم بر ۷۵) از این تعلیق را بردارید و به آن ۹/۱۹۰ میلی لیتر محیط اضافه کنید تا به حجم ۹/۶ میلی‌لیتر برسد و به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر از تعلیق سلولی اضافه کنید.

این روش محاسبه زمانی که اولین بار است با سلولی کار میکنید و در مقالات مشابه تعداد بسیار متغیری سلول برای پر کردن چاهک‌ها ذکر شده است، بسیار مفید است. اگر فلاسکی با ۶۰٪ یا ۸۰٪ پرشدگی در اختیار داشته باشید به ترتیب باید سطحی معادل ۳۵/۸۴ یا ۲۶/۸۸ در اختیار داشته باشید. که از فرمول زیر محاسبه می‌شود.

سطح مورد نیاز= (درصد پرشدگی مورد نظر×تعداد چاهک‌های لازم×۰/۳۲)/درصد پرشدگی فلاسک حاوی سلول

* هنگام پر کردن چاهک‌ها ظرف محتوی سلول را هر از گاهی به آرامی تکان دهید تا از تهنشین شدن سلول‌ها جلوگیری کنید و درپایان تعداد برابری سلول به چاهک‌ها رسیده باشد. 

* هنگام خارج کردن محیط کشت پلیت را اندکی با زاویه نگه دارید تا محیط در یک محل جمع شود و برای تخلیه آن نیازی نباشد سر سمپلر را با کف پلیت تماس دهید. بهتر است تیپ را به دیواره چاهک تکیه دهید تا لرزش دست و … باعث برخورد آن با کف پلیت نشود. برخورد سر سمپلر با کف پلیت موجب کنده شدن سلول‌های چسبیده و خطا در تست ‌می‌شود.

 

اساس روش MTT

سنجش MTT برای اندازه‌گیری فعالیت متابولیکی سلول‌ها به عنوان شاخص زنده ماندن، تکثیر و سمیت سلولی استفاده می‌شود. این روش رنگ‌سنجی بر اساس احیای نمک زرد تترازولیوم (3-(4،5-دی متیل تیازول-2-یل)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید یا MTT) به کریستال‌های فورمازان بنفش رنگ توسط سلول‌های فعال متابولیکی است. سلول‌های زنده حاوی آنزیم‌های اکسیدوردوکتاز وابسته به NAD(P)H هستند که MTT را به فرمازان کاهش می‌دهد. با حل کردن کریستال‌های نامحلول فرمازان در حلال DMSO، محلول بنفشی حاصل می‌شود که شدت رنگ آن با میزان فعالیت سلول و درنتیجه تعداد سلول‌ها رابطه خطی دارد. شدت جذب با استفاده از الایزا ریدر در بازه ۵۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر سنجیده می‌شود. هر چه محلول تیره تر باشد، تعداد سلول‌های زنده و فعال متابولیک بیشتر است. از کاربردهای این روش می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

* کمی‌سازی رشد و زنده‌مانی سلولی

* اندازه گیری تکثیر سلول در پاسخ به فاکتورهای رشد، سایتوکاین‌ها و مواد مغذی

* اندازه گیری سمیت سلولی ناشی از تیمار با انواع داروها، مواد سمی یا مهارکننده رشد

عیب یابی

MTT از روش‌های بسیار پرکاربرد برای سنجش اثر تیمارهای مختلف بر قابلیت حیات سلول است. با این حال این تست نیز محدودیت‌هایی دارد:

تشکیل کریستال‌های فورمازان بدون وجود سلول

یکی از کنترل‌هایی که باید برای تست MTT در نظر گرفته شود چاهک‌های فاقد سلول و حاوی تیمار است. چراکه در برخی موارد برهمکنش میان اجزای تیمار با نمک تترازولیوم موجب تشکیل کریستال‌های فورمازان می‌شود.

تاثیر مستقیم تیمار بر فعالیت آنزیم‌های NAD(P)H-اکسیدوردوکتاز

همان‌طور که گفته شد اساس این روش فعالیت آنزیمی میتوکندریایی است برخی تیمارها با افزایش یا کاهش فعالیت میتوکندری در نتیجه تست خطا ایجاد می‌کنند.