پروتوسیب

سنجش پروتئین به روش برادفورد

کیت برادفورد پرتوسیب روشی آسان و دقیق برای تعیین غلظت پروتئین به روش برادفورد است. دستورالعمل این کیت برای سنجش پروتئين در دو بازه غلظت ۱۰۰μg/ml تا ۳۰۰ و ۵μg/ml تا ۳۰ بهینه شده است. کیت برادفورد شامل معرف ۵x، محلول شاهد و استاندارد BSA است. طول عمر مفید محصول ۶ ماه است.

کد محصول، محتویات و قیمت
کد محصول محتویات تعداد تست قیمت (تومان)
۳۵۰۱-۲۰۰ معرف برادفورد (۵ml محلول ۵x)
استاندارد BSA (۱ml محلول ۲mg/ml)
میکروپلیت: ۲۰۰
میکروتیوب: ۲۵
۳۲۰/۰۰۰
۳۵۰۱-۵۰۰ معرف برادفورد (۱۳ml محلول ۵x)
استاندارد BSA (۲ml محلول ۲mg/ml)
میکروپلیت: ۵۰۰
میکروتیوب: ۶۰
۵۵۰/۰۰۰
شیوه نگهداری

محصول همراه با یخ ارسال می‌شود.

پس از دریافت کیت را در یخچال در دمای ۴ درجه نگهداری کنید.

خلاصه دستورالعمل استفاده از کیت

مشروح دستور‌العمل را در اینجا بخوانید. پروتکل کیت به شرح زیر خلاصه شده است:
۱- مقدار مورد نیاز از معرف را به نسبت ۱ به ۴ با آب مقطر ترکیب کنید تا به غلظت ۱x برسد.
۲- اجازه دهید نمونه‌ها و معرف با محیط هم‌دما شود.
۳- نمونه‌های استاندارد را مطابق جدول ۱ یا ۲ تهیه کنید.
۴- مطابق جدول ۳ حجم مناسبی از نمونه (یا محلول‌های استاندارد) را در ۳ تکرار با معرف ترکیب کنید.
۵- نمونه‌ها را ۱۰ دقیقه در دمای محیط و به دور از نور مستقیم نگهداری کنید. (از فویل آلومینیومی برای پوشاندن میکروتیوب‌ها یا میکروپلیت استفاده کنید.
۶- با دستگاه اسپکتروفوتومتر، جذب نوری محلول داخل میکروتیوب‌ها را در طول موج ۵۹۵ نانومتر قرائت کنید.

۱۰-۳۰ μg/ml ۱۰۰-۳۰۰ μg/ml
میکروتیوب ۵۰۰ μl :نمونه پروتئین
۵۰۰ μl :معرف کوماسی
۱۰۰ μl :نمونه پروتئین
۱۰۰۰ μl :معرف کوماسی
میکروپلیت ۱۲۵ μl :نمونه پروتئین
۱۲۵ μl :معرف کوماسی
۵۰ μl :نمونه پروتئین
۵۰ μl :معرف کوماسی

نکات کلیدی

* از ظروف کاملا تمیز برای انجام تست استفاده کنید.

* برای رقیق کردن نمونه‌‌ها یا تهیه رقت‌های استاندارد از همان بافری استفاده کنید که نمونه در آن حل شده است. تا تاثیر pH حلال را از تغییر رنگ معرف حذف کنید. به خصوص اگر از بافرهای بازی استفاده می‌کنید بهتر است نمونه‌های استاندارد را نیز در همان بافر تهیه کنید.

* به مقدار مورد نیاز از معرف را به غلظت ۱x برسانید. در صورت نگهداری صحیح معرف در ظروف تمیز، دمای ۴C֯ و تاریکی، حداکثر زمان نگهداری معرف در حالت ۱x یک هفته است.

* معرف رنگ می‌تواند با کووت‌های کوارتز واکنش دهد. بهتر است از کووت‌های شیشه‌ای یا پلاستیکی استفاده کنید. آلودگی‌های روی ظروف شیشه‌ای می‌تواند بر اندازه‌گیری شما تأثیر بگذارد، قبل از استفاده از تمیز بودن آنها اطمینان حاصل کنید. اگر از یک کووت برای تمام اندازه‌گیری‌ها استفاده می‌کنید؛ قبل از سنجش نمونه‌بعدی، رنگ به جا مانده روی بدنه کووت را با گرداندن محلول الکلی در آن تمیز کنید.

* در صورتیکه دستگاه اسپکتروفوتومتر یا پلیت ریدر فاقد فیلتر ۵۹۵ نانومتر باشد، جذب نمونه را در هر طول موجی بین ۵۷۰ تا ۶۱۰ نانومتر قرائت کنید.

اساس روش برادفورد

روش برادفورد (‌Bradford) یکی از پرکاربردترین تکنیک‌هایی است که برای تعیین غلظت پروتئین در محلول توسعه یافته است. رنگ کوماسی بریلینت بلو (Coomassie Brilliant Blue G-250) که جز اصلی این روش است به سه فرم کاتیونی (قرمز)، خنثی (سبز) و آنیونی (آبی) وجود دارد. تشکیل کمپلکس رنگ و پروتئین در محیط اسیدی باعث تغییر کوماسی از فرم کاتیونی یا خنثی (رنگ قرمز یا سبز) به فرم آنیونی (رنگ آبی) می‌شود. تشکیل کمپلکس رنگ-پروتئین متاثر از برهمکنش‌های الکترواستاتیک گروه‌های سولفونات رنگ با باقی‌مانده‌های اسیدآمینه‌های بازی مانند آرژنین و لایزین است. برهم‌کنش‌های آبگریزی رنگ با باقی‌مانده‌های تریپتوفان، فنیل‌آلانین و تیروزین نیز عامل موثر دیگری در تشکیل این کمپلکس است. در شرایط اسیدی رنگ به فرم پروتونه است (Amax = 470 nm) و زمانی که به پروتئین متصل می‌شود به فرم پایدار غیر پروتونه آبی رنگ تبدیل می‌شود (Amax = 595 nm). ثابت جذب کمپلکس رنگ-پروتئین می‌تواند تا بیش از ۱۰ برابر غلظت اولیه پروتئین ثابت باقی‌ بماند. بنابراین در این محدوده قانون بیر-لامبرت صادق است و می‌توان از این طریق غلظت نمونه مجهول را با انتخاب نسبت مناسبی از معرف و نمونه پروتئین بدست آورد.

عیب یابی
شدت جذب کمتر از حد انتظار

وزن ملکولی پروتئین کم است. حداقل وزن ملکولی مجاز در روش برادفورد ۳۰۰۰-۵۰۰۰ دالتون است. اگر وزن ملکولی پروتئین مورد سنجش کمتر است از روش‌های دیگری مانند BCA استفاده کنید.

عاملی مداخله‌گر وجود دارد. نمونه حاوی عاملی مداخله‌گر مانند دترجانت‌ها است. نمونه پروتئین را با بافر رقیق کنید. از همین بافر برای تهیه رقت‌های استاندارد استفاده کنید.

شدت جذب بیش از حد انتظار

غلظت پروتئین در نمونه خیلی زیاد است. نمونه را رقیق کنید و تست را تکرار کنید.

عاملی مداخله‌گر وجود دارد. نمونه حاوی عاملی مداخله‌گر مانند دترجانت‌ها است. نمونه پروتئین را با بافر رقیق کنید. از همین بافر برای تهیه رقت‌های استاندارد استفاده کنید.

مشاهده رنگ آبی تیره در تست برادفورد

غلظت عوامل بازی در نمونه زیاد است. pH نمونه بیش از حد مجاز در تست برادفورد است. نمونه را رقیق یا دیالیز کنید تا از غلظت آن بکاهید.

مشاهده رسوب آبی‌ رنگ در تست برادفورد

غلظت دترجانت‌ها بیش از حد مجاز است. نمونه را رقیق یا دیالیز کنید تا از غلظت آن بکاهید و مجددا تست را تکرار کنید. در صورتی که رسوب از بین نرفت از روش‌های دیگر مانند BCA استفاده کنید.

غلظت مجاز مواد مداخله‌گر را می‌توانید از مشاهده کنید. نکته دیگر اینکه اگر اجزای نمونه شما در این لیست وجود ندارد، یا به حضور عاملی مداخله‌گر در نمونه خود مشکوک هستید می‌توانید از این روش برای تشخیص آن استفاده کنید: اگر به پروتئین مورد نظر (یا پروتئین استاندارد) به شکل خالص دسترسی دارید، دو منحنی استاندارد رسم کنید، یکی برای پروتئین در بافری که با آن کار می‌کنید، دیگری برای پروتئین در آب. دو منحنی استاندارد را با هم مقایسه کنید. اگر بافر در اندازه‌گیری شما تداخل نداشته باشد، دو منحنی استاندارد شیب یکسانی خواهند داشت. در غیر این صورت می‌توانید از سایر تکنیک‌های موجود استفاده کنید.