استخراج اگزوزوم
روش های مختلفی برای استخراج اگزوزوم‌ها از کشت سلول یا استخراج اگزوزوم‌ها از انواع مایعات بیولوژیکی توسعه یافته است که شامل سانتریفیوژ، کروماتوگرافی، فیلتراسیون، رسوب بر پایه پلیمر، جداسازی ایمونولوژیک (جداسازی تمایلی) و میکروفلئیدیک هستند. با توجه به کاربردهای بالقوه اگزوزوم‌ها در تشخیص و درمان بیماری‌ها تلاش برای توسعه روشی کم‌هزینه با کارایی بالا برای استخراج اگزوزوم‌ها اهمیت زیادی دارد تا اگزوزوم‌هایی با خلوص بالا و دارای عملکرد به دست بدهد.
استخراج اگزوزوم با اولتراسانتریفیوژ
اولتراسانتریفوژ یا سانتریفوژ با دور بالا با قابلیت تولید نیروی گریز از مرکز تا ۱۰۰.۰۰۰g، قادر است ذرات ریزی مانند باکتری‌ها، ویروس‌ها و اندامک‌های سلولی را جداسازی کند، اولتراسانتریفوژ سه روش رایج جداسازی دارد: سانتریفیوژ افتراقی، سانتریفیوژ شیب چگالی
سانتریفوژ افتراقی در جداسازی اگزوزوم‌ها
سانتریفیوژ افتراقی (Differential ultracentrifugation) رایج‌ترین روش تخلیص اگزوزوم است که به نام‌های اولتراسانتریفیوژ (Simple ultracentrifugation) و روش رسوب‌دهی (Pelleting method) نیز شناخته می‌شود. اساس جداسازی اگزوزوم‌ها در این روش شکل و سایز ذرات موجود در نمونه است. روش سانتریفوژ افتراقی برای تخلیص اگزوزوم متشکل از چندین مرحله سانتریفوژ است که در هر مرحله دور سانتریفوژ افزایش می‌یابد. در مراحل ابتدایی، سانتریفوژ با دور پایین (۳۰۰۰g) صورت می‌گیرد تا سلول‌ها، دبری‌ها و ذرات بزرگتر جدا شوند. مرحله بعد شامل سانتریفیوژ با دور ۱۰.۰۰۰g، برای جداسازی وزیکول‌های درشتتر است. در مرحله نهایی، به کمک اولتراسانتریفیوژ با دور ۱۰۰.۰۰۰g اگزوزوم‌ها تخلیص می‌شوند. بهتر است بعد از مرحله اول (سانتریفیوژ دور پایین)، در هر مرحله از میکروتیوب‌های مخروطی استفاده شود تا جمع‌آوری سوپرناتانت را تسهیل کند. نکته لازم به ذکر بعدی، چگونگی تنظیم شتاب افزایش یا کاهش سرعت روتور است. پیشنهاد شده است سرعت روتور با بیشترین شتاب ممکن افزایش یابد و پس از پایان زمان سانتریفیوژ با کمترین شتاب ممکن سرعت کاهش پیدا کند تا آسیب کمتری به پلت وارد شود.
مزایا و معایب سانتریفیوژ افتراقی در استخراج اگزوزوم‌ها
جداسازی اگزوزوم با سانتریفیوژ افتراقی جز پرکاربردترین روش‌های استخراج اگزوزوم است. پروتکل ساده‌ای دارد و نیاز به مهارت فنی خاصی ندارد به همین دلیل جز روش‌های پرطرفدار در تحقیقات به حساب می‌آید. دورهای متوالی سانتریفیوژ برای ته نشین کردن اجسام آپوپتوتیک و بقایای سلولی، میکرووزیکول‌ها و اگزوزوم‌ها در نظر گرفته‌شده‌است. با این حال، به دلیل شباهت ویژگی‌های ته‌نشینی انواع مختلف وزیکول‌های خارج سلولی، سانتریفیوژ افتراقی که برای جداسازی اگزوزوم اعمال می‌شود، اغلب نتایج رضایت‌بخشی را نشان نمی‌دهد و بازده نسبتاً پایین و خلوص ناکافی جمعیت اگزوزوم ارائه می‌کند. در این روش به دلیل هدر رفت بالا، بازده نهایی زیاد نیست و به همین دلیل برای استخراج اگزوزوم از نمونه‌هایی با حجم کم مانند سرم مناسب نیست. برای نمونه‌های بزرگتر مانند ادرار و سوپرناتانت کشت سلولی می‌تواند مورد استفاده قرار بگیرد. علاوه بر این، پروتکل‌های سانتریفیوژ یکسان معمولاً با روتورهای مختلف و بدون در نظر گرفتن تفاوت‌های ویسکوزیته محلول‌ها اعمال می‌شوند، که اغلب منجر به عدم تشابه داده‌های به‌دست‌آمده توسط گروه‌های تحقیقاتی مختلف می‌شود. قابل ذکر است، این ناهمگونی احتمالاً مسئول تفاوت در نسبت های گزارش شده اگزوزوم‌ها و وزیکول‌های سلولی است. بنابراین باید توجه داشت این روش نیاز به ست آپ ویژه نسبت به دستگاه سانتریفوژ و نمونه مورد استفاده دارد. با در نظر گرفتن همه مزایا و معایب برشمرده به دلیل اینکه محتوای پروتئینی اگزوزوم دستخوش تغییر نمی‌شود جهت انجام مطالعات پروتئینی پیشنهاد می‌شود.
استخراج اگزوزوم با اولتراسانتریفوژ شیب غلظت
وجود پروتئین‌های اگریگه شده، اجسام آپاپتوتیک و آلودگی‌های دیگر بزرگترین نقص روش اولتراسانتریفوژ افتراقی است، از روش اولتراسانتریفوژ با استفاده از شیب غلظت، برای بهبود جداسازی ذرات بر اساس چگالی شناوری (Buoyant density) آنها استفاده می‌شود. این روش ابتدا برای جداسازی زیرگروه‌های سلول‌های خونی در مطالعات هماتولوژیک مورد استفاده بوده است. به کمک این روش حتی اندامک‌های سلولی نیز قابل جداسازی است. این روش بر این اساس عمل می‌کند که در یک نیروی گریز از مرکز (centrifugal force) ثابت، اجزای مختلف نمونه در نواحی مستقر می‌شوند که چگالی یکسانی با چگالی آنها دارد (isodensity zone) و بدین طریق اگزوزوم را از سایر اجزای محلول جدا می‌نماید، به این منظور نمونه به یک محیط زیست‌سازگار (Biocompatible) دارای شیب غلظت افزوده می‌شود و اگزوزوم‌ها در طول محلول حرکت می‌کنند تا به نقطه هم‌چگالی خود برسند.
اگرچه اولتراسانتریفیوژ با گرادیان چگالی اگزوزوم‌هایی با خلوص بالاتر تولید می‌کند و ساختار آنها را نیز حفظ می‌کند، اما فعالیت بیولوژیکی ممکن است دستخوش تغییر شود. تغییرات در خواص اگزوزوم‌ها در اثر فشار اسمزی محیط و یا قرار گرفتن در معرض عامل چگالی، (به عنوان مثال، سوکروز) می‌تواند رخ دهد.
زمان اولتراسانتریفیوژ یک پارامتر حیاتی در این شیوه است زیرا سایر ذرات با چگالی مشابه ممکن است بخش اگزوزوم را آلوده کنند. به طور کلی برای دستیابی به جداسازی و غنی سازی خوب، اولتراسانتریفیوژ با گرادیان چگالی نیاز به سانتریفیوژ طولانی (۱۴-۱۸ ساعت) با نیروی بالاتر (۱۰۰.۰۰۰g-۱۶۰.۰۰۰g) دارد. متأسفانه، این عوامل ممکن است به تجمع وزیکول‌ها و یا آسیب مکانیکی احتمالی منجر شود. با این حال، اگزوزوم‌های به‌دست‌آمده با این روش برای تجزیه و تحلیل با کاربردهای پایین‌دستی بسیار حساس، از جمله پروتئومیکس، ترنسکریپتومیکس، miRNA و مطالعات توالی‌یابی مناسب هستند.
سانتریفوژ با شیب غلظت به دو شیوه ایزوپیکنیک (isopycnic) و سرعت منطقه‌ای (moving zone) انجام می شود برای اطلاع بیشتر اینجا کلیک کنید.
استخراج اگزوزوم به روش سانتریفیوژ ایزوپیکنیک
در این روش یک محیط زیست‌سازگار با شیبی از غلظت درون لوله آزمایش قرار می‌گیرد، به گونه‌ای که غلظت آن با حرکت به سمت بالای لوله کاهش یافته و طیفی از غلظت‌ها را درون لوله ایجاد می‌کند، با افزودن نمونه در قسمت بالایی لوله و سانتریفوژ آن به مدت طولانی، ذرات نمونه به سمت پایین حرکت می‌کنند، تا زمانی که هر ذره در نقطه‌ی ایستایی (Static position) خود که غلظتش با چگالی ذره یکسان است متوقف می‌شود، به همین دلیل به این روش bottom-loading نیز گفته می‌شود.
استخراج اگزوزوم به روش سانتریفیوژ سرعت منطقه‌ای (Rate-zonal)
روش سانتریفیوژ سرعت منطقه‌ای (Rate-zonal centrifugation) که به آن سانتریفیوژ منطقه متحرک (moving-zone centrifugation) نیز گفته می‌شود، ذرات را براساس هردو معیار سایز و چگالی جداسازی می‌کند و در نتیجه قادر است برخلاف روش ایزوپیکینیک، اگزوزوم را از اجسام آپاپتوتیک جدا نماید.
در این روش دو غلظت در لوله آزمایش داریم؛ اول محلول کم چگالی که دانسیته آن از همه ذرات نمونه کمتر است و دوم محیط چگالی کف لوله آزمایش قرار گرفته‌است. مانند یک کوسن عمل می‌کند، در اثر سانتریفوژ، به این علت که تمامی اجزای نمونه از محلول رویی چگالتر هستند، نه براساس چگالی که بر اساس جرم (وزن) و اندازه (سایز) به سمت پایین حرکت می‌کنند (مانند روش اولتراسانتریفیوژ افتراقی)، کوسن چگال کف لوله، مانع رسوب و از دست رفتن اگزوزوم‌ها و آلودگی آنها با سایر ذرات داخل محیط می‌شود، در یک سانتریفوژ طولانی همه ذرات و وزیکول‌ها در پایین‌ترین نقطه قرار خواهند گرفت، در نتیجه برای اینکه همه ذرات در انتها ته‌نشین نشوند، زمان سانتریفوژ باید به دقت تعیین شود.
استخراج اگزوزوم به وسیله رسوب‌دهی با پلیمر
روش رسوب دهی با پلیمر روشی است که در آن یک پلیمر به شدت آبدوست با مولکول‌های آب اطراف اگزوزوم میانکنش داده، یک ریزمحیط آبگریز اطراف اگزوزوم ایجاد می‌کند که درنتیجه آن اگزوزوم‌ها رسوب می‌کنند. در این روش ابتدا یک پیش‌تیمار (pre-treatment) برای حذف بقایای سلولی صورت گرفته و سپس نمونه یک شب تا صبح در دمای یخچالی با پلیمر انکوبه می‌شود و پس از آن با یک سانتریفوژ در سرعت پایین اگزوزوم‌ها رسوب می‌کنند.
استخراج به روش رسوب دهی که بعد از روش اولتراسانتریفوژ دومین روش استخراج اگزوزوم محسوب می‌شود، ساده، آسان و سریع است. برخلاف اولتراسانتریفوژ و کروماتوگرافی قابلیت استخراج همزمان از تعداد زیادی نمونه را داراست. مقدار بازده اگزوزوم استخراجی این روش بالاست. اما محصول آن ممکن است آلودگی پروتئینی به همراه داشته باشد که اگر مطالعات پایین دست آن، مطالعات پروتئومیکس باشد لازم است مورد توجه قرار گرفته و با روش‌هایی مانند سانتریفوژ، فیلتراسیون یا ژل فیلتراسیون حذف شود، مزیت عمده این روش حفظ قابل توجه محتوای ژنتیکی اگزوزوم نسبت به سایر روش‌ها است که روش رسوب‌دهی را به روشی مطلوب جهت مطالعات مولکولی بدل می‌سازد. استخراج به روش رسوب دهی با پلیمر علاوه بر اینکه برای نمونه‌های کوچک قابل انجام است، قابلیت استخراج از حجم زیاد نمونه را نیز داراست و مقیاس‌پذیری بالایی دارد. به دلیل اینکه استخراج به روش رسوب دهی به تجهیزات ویژه‌ای نیاز ندارد، آن را به جذابترین روش جهت تحقیقات کلینیکی تبدیل کرده است. کیت استخراج اگزوزوم Exoquick و کیت استخراج اگزوزوم اگزوسیب براین اساس طراحی شده اند که اگزوزوم‌هایی با خلوص مطلوب و بازده بالا در اختیار قرار می‌دهند.
استخراج اگزوزوم با اولترافیلتراسیون
اولترافیلتراسیون از دیگر روش‌های رایج استخراج اگزوزوم است. مشابه سایر روش‌های فیلتراسیون، از یک غشا نانو که قادر است ذرات را براساس سایز فیلتر کند استفاده می‌شود. غشاهای تجاری با سایز منافذ متنوعی در دسترس هستند که کار را برای جداسازی ذرات با سایز دلخواه آسان نموده‌اند. اولترافیلتراسیون می‌تواند به تنهایی برای استخراج اگزوزوم مورد استفاده قرار گیرد و با انتخاب فیلترهای مناسب، ذرات اگزوزوم را از میکرووزیکول‌ها تمیز دهد. یا به عنوان مکمل به افزایش خلوص اگزوزوم‌های جدا شده با استفاده از روش‌های دیگر کمک نماید. همچنین می‌توان این روش را می‌توان به عنوان جایگزین گام‌هایی از اولتراسانتریفوژ به کار گرفت تا به کاهش زمان استخراج کمک کند.
پروتکل‌های متعددی برای اولترافیلتراسیون وجود دارد که کار را برای مقایسه این روش با سایر روش‌های استخراج دشوار می‌نماید. دو مثال معروف برای انواع استخراج اگزوزوم به روش اولترافیلتراسیون، Tandem-configured microfilter و Sequential هستند. استخراج اگزوزوم به روش اولترافیلتراسیون تاندم (Tandem-configured microfilter)، دو میکروفیلتر با قطر حدود ۲۰ و ۲۰۰ نانومتری تعریف شده است، وزیکول‌های بزرگ شامل اجسام آپاپتوتیک و میکروزیکول‌ها، با عبور نمونه از غشا ۲۰۰ نانومتری گیر می‌افتند، و ذرات کوچکتر مانند پروتئین‌ها از غشا ۲۰ نانومتری عبور می‌کنند.
در روش اولترافیلتراسیون ترتیبی (sequential ultrafiltration)، نمونه ابتدا از یک غشا (با منافذ دارای قطر) ۱۰۰۰ نانومتری عبور داده می‌شود تا از ذرات بزرگی مانند اجسام آپاپتوتیک و بقایای سلولی رهایی یابد و سپس از غشا ثانویه‌ای با قطر 500kD می‌گذرد تا پروتئین‌ها و سایر ذرات کوچک آن جدا شوند و در نهایت با عبور از غشای ۲۰۰ نانومتری اگزوزوم‌ها تخلیص می‌شوند، کیت استخراج ExoMir بر این اساس طراحی شده است.
محبوبیت روش اولترافیلتراسیون به علت کارآیی بالا، عدم نیاز به زمان و تجهیزات زیاد و پروتکل ساده رو به افزایش است، همچنین اولترافیلتراسیون قابلیت افزایش مقیاس دارد و می‌تواند گزینه مناسبی برای استفاده در مقیاس صنعتی باشد، لازم به ذکر است این روش با مشکلاتی از جمله آلودگی با ذراتی که وزن و سایزی مشابه اگزوزم دارند، کوتاه شدن عمر غشاهای فیلتراسیون در اثر به دام افتادن و تجمع اگزوزوم‌ها، مناسب نبودن برای مایعاتی با ویسکوزیته بالا، و تغییر شکل اگزوزوم‌ها رو به رو است. هرچند برای حل مشکلات راهکارهایی از جمله استفاده از پروتئیناز برای کاهش ویسکوزیته، اولترافیلتراسیون جریان مماسی (tangenital flow filtration)، اولترافیلتر همزن‌دار و … معرفی شده‌اند اما معمولا برای بازدهی بیشتر این روش در ترکیب با روش‌های دیگر به شکل ترکیبی استفاده می‌شود.
جداسازی اگزوزوم با استفاده از کروماتوگرافی اندازه‌ای
اساس روش کروماتوگرافی این است که ذرات موجود در محلول نمونه به دلیل تفاوت در سایز مولکولی، با سرعت‌های متفاوتی از ستون کروماتوگرافی عبور کنند. SEC از دو فاز متحرک و فاز ثابت تشکیل شده است. فاز ثابت یا ستون کروماتوگرافی یک ژل فیلتراسیون متخلخل است، با عبور فاز متحرک (که در اینجا همان مایع زیستی) است از داخل ژل، مولکول‌های کوچک درون منافذ به دام افتاده در حالیکه مولکول‌های بزرگتر به دلیل اینکه نمی‌توانند به منافذ وارد شوند سریعتر از ستون کروماتوگرافی خارج می‌شوند، فاز ثابت از جنس ژل‌های پلیمری متنوعی از جمله دکستران (Sefadex)، آگارز (Sefarose)، پلی آکریل آمید (BioGel یا Sephacryl) می‌باشد. در سال ۲۰۱۴ یک روش کروماتوگرافی یک مرحله‌ای برای کروماتوگرافی ابداع شد که در آن وزیکول‌های کوچکتر (از جمله اگزوزوم) از وزیکول‌های بزرگتر و پروتئین‌های محلولی که در غشا وزیکول قرار ندارند به نحو موثری جدا می‌گردند، البته SEC قادر نیست اگزوزوم را از وزیکول‌هایی با سایزی مشابه جدا کند و برای این کار لازم است با سایر روش‌ها به ویژه ایمونوکپچر ترکیب شود.
از آنجا که SEC قادر است پروتئین‌های محلول را حذف نماید، برای استخراج اگزوزوم از پلاسما روش مطلوبی به نظر می‌رسد، علاوه بر اختصاصی بودن نسبتا خوب این روش برای جداسازی اگزوزوم، زمانی حدود ۲۰ دقیقه (بسیار کوتاه) در این روش نیاز است و اگر مساله هزینه درمیان نباشد قابلیت استخراج در ابعاد وسیع را نیز داراست. اما SEC نیز دارای نقص‌هایی است، از جمله اینکه بازده بازیابی اگزوزوم بالایی ندارد و هرچند خصوصیات وزیکولار اگزوزوم در این روش به خوبی حفظ می‌شود اما محتوای پروتئین و RNA آن می‌تواند تحت تاثیر قرار گیرد، همچنین حجم زیادی از مایعات زیستی برای شروع استخراج با SEC نیاز است تا مقدار کم اگزوزوم استخراجی را جبران کند. همچنین مشاهده شده‌است اگزوزوم‌های جدا شده با این روش گستره توزیع اندازه وسیعی را شامل می‌شوند که به معنی وجود آلودگی و ناخالصی‌هایی مانند پروتئین‌های اگریگه و لیپوپروتئین‌هاست.
روش ایمونوکپچر مطرحترین روش جداسازی اگزوزوم بر اساس میل ترکیبی (Affinity) است، بعضی از پروتئین‌ها و رسپتورهای پروتئینی، در همه اگزوزوم‌ها فارغ از اینکه از چه سلولی منشا می‌گیرند مشترک هستند، این خصوصیت امکان شناسایی و استخراج اگزوزوم با آنتیبادی اختصاصی آن ایجاد کرده است. از نظر تئوری، هر پروتئین یا جز غشایی که در غشا اگزوزوم قرار داشته باشد و همتایی در مایع خارج سلولی نداشته باشد، می‌تواند به عنوان هدف جداسازی اگزوزوم بر اساس میل ترکیبی (immunoaffinity-based exosome capture) مورد استفاده قرار گیرد.
در طول دهه‌های گذشته مارکرهای متنوعی برای اگزوزوم ثبت شده است که در میان آنها پروتئین‌های غشاگذر (transmembrane) مانند Rab5, CD81, CD63, CD9, CD82, annexin و Alix به صورت گسترده‌ای برای شناسایی و استخراج اگزوزوم مورد استفاده قرار گرفته‌اند و کمپانی‌های بزرگی مانند Abcam, Thermofisher و Milteny biotech برای این مارکرها کیت شناسایی تولید کرده‌اند.
در این روش با تثبیت آنتی‌بادی‌ها روی سطح جامدی که می‌تواند بید مغناطیسی (Magnetic beads)، میکروتیپ یا سطح پلیت باشد، بستری برای اتصال اگزوزوم به آنتیبادی فراهم می‌شود. در اثر انکوبه نمونه با حامل آنتی بادی، اگزوزوم به واسطه آنتیبادی جذب حامل می‌شود. نهایتا با شستشو، اگزوزوم از کمپلکس جدا می‌شود. به دلیل تنوع در حامل‌های آنتی بادی و استفاده ترکیبی از ایمونوکپچر به همراه سایر روش‌های استخراج، پروتکل‌های متعددی برای این روش ذکر شده است.
در مجموع، در روش ایمونوکپچر زمان استخراج کاهش یافته و درصد خلوص افزایش می‌یابد اما راندمان بالایی ندارد. این روش برای استخراج زیرگروه‌های خاصی از اگزوزوم‌های خارج سلولی، دیاگنوز و اگزوزوم با منشا خاص بسیار مورد توجه است. برای مثال از آنتی بادی علیه EpCAM که در سطح اگزوزوم‌های با منشا سرطانی وجود دارد برای شناسایی اگزوزوم‌های مشتق از تومور مورد استفاده قرار گرفته و حتی تجاری سازی شده است. همچنین برای جداسازی از محیط کشت مناسب می‌باشد. به علت مهار رقابتی سایر بیوپلیمرهای موجود در مایعات بیولوژیک، برای استخراج از سرم و.. ایده‌آل نیست. افزون بر این قیمت بالای آنتیبادی و بیدهای مگنتیک مانع استفاده از ایمونوکپچر در حجم‌های بالاست.
یکی از مشکلات مهم دیگر این روش سخت بودن جداسازی اگزوزوم سالم از کمپلکس آنتیبادی است به خصوص زمانی که سالم و عملکردی بودن اگزوزوم حائز اهمیت باشد، افزون براین فاز جامدی که آنتی بادی روی آن فیکس شده است ممکن است اتصالات غیر اختصاصی با سایر اجزای نمونه برقرار کند که با عامل بلوکه‌کننده (Blocking agent) هم قابل رفع نیست.