رنگ‌آمیزی آلبرت
رنگ‌های گوناگونی در طول زمان برای تشخیص باکتریها ساخته شده است. این رنگ‌ها باکتریها را براساس خصوصیات مورفولوژیک و یا ویژگی‌های خاص آن‌ها رنگ‌آمیزی و متمایز می‌کنند. پرکاربردترین رنگ‌های باکتری‌شناسی رنگ‌آمیزی گرم، رنگ‌آمیزی اسیدفست و رنگ‌آمیزی اندوسپور هستند. رنگ آلبرت برای شناسایی ساختارهای خاصی که گرانول‌های متاکروماتیک نامیده می‌شوند، استفاده می‌شود، رنگ‌های Neisser و Pugh دو رنگ دیگری هستند که برای تشخیص گرانول‌ها در باکتری مورد استفاده قرار می‌گیرند.
رنگ آلبرت جهت رنگ‌آمیزی پلیمرهای فسفات استفاده می‌شود که درون گرانول‌های درون سلولی به نام گرانول‌های متاکروماتیک ذخیره می‌شوند این گرانول‌ها متاکروماتیک نامیده می‌شوند زیرا قادرند رنگ را تغییر دهند برای مثال هنگامی که با رنگ آبی رنگ آمیزی شوند به رنگ قرمز ظاهر می‌گردند (metachromasia). گرانول‌های متاکروماتیک همچنین به نام‌های volutin bodies ،Babe-Ernst granules و polar bodies شناخته می‌شوند. باکتری از این گرانول‌های متاکروماتیک به عنوان ذخیره فسفات و انرژی استفاده میکند زیرا فسفات در محیط های طبیعی اغلب ماده‌ی مغذی محدود کننده است. بنابراین، در صورتی که سلولی در شرایط مطلوب قرار گیرد، پلی‌فسفات را برای رویارویی با کمبود مواد غذایی در ولوتین‌ها ذخیره میکند.
کاربرد رنگ‌آمیزی آلبرت
رنگ آلبرت یک رنگ افتراقی است که عمدتا جهت افتراق کورینه باکتریوم دیفتریا از سایر گونه های دیفتری که غیر بیماری زا non-pathologic هستند، استفاده می‌شود.
کورینه باکتریها باکتری‌های گرم مثبت هستند که اسپور تشکیل نمی‌دهند و باسیل‌های غیرمتحرکی هستند که حاوی گرانول‌های متاکروماتیک (ولوتین) هستند که اجسام اینکلوژن (inclusion body) داخل سلولی هستند و در بعضی باکتریها برای نگهداری فسفات غیرآلی (complexed inorganic poly-posohate) و آنزیم‌ها وجود دارند، وقتی این گرانول‌ها در معرض رنگ آمیزی با متیلن بلو قرار می‌گیرند، به رنگ قرمز-بنفش redish-purple ظاهر می‌شوند. معروفترین کورینه باکتری، کورینه باکتریوم دیفتریا است که عامل دیفتری* است، به طور معمول کورینه باکتریوم دیفتریا را در محیط کشت انتخابی *Loeffler agar یا Mueller Tellurite Agar یا tinsdale tellurite agar کشت داده می‌شود، از کلنی‌های آن کشت مایع تهیه می‌شود که برای رنگ آمیزی استفاده می‌شود.
*دیفتری عفونت نازوفارنژیال nasopharyngeal که بینی و گلو را آلوده میکند و همچنین پوست را تحت تاثیر قرار می‌دهد و سبب علائمی مانند گلودرد و تب و سرفه و گرفتگی صدا شده و در صورت عدم درمان می‌تواند عوارضی مانند فلج دست و پا و ناراحتی‌های کلیوی و قلبی و تهدید حیات بیمار را منجر شود بنابراین تشخیص و درمان به موقع عفونت کورینه باکتریوم دیفتریا ضروری است.
از رنگ آلبرت به طور عمده جهت شناسایی کورینه باکتریوم دیفتریا که سبب بروز بیماری دیفتری است، استفاده می¬شود. افتراقی بودن رنگ آلبرت سبب تشخیص کورینه باکتریوم دیفتریا از سایر دیفتروپیدهای غیربیماری زا که فاقد گرانول‌های متاکروماتیک هستند می‌شود.
اساس رنگ‌آمیزی آلبرت
رنگ آلبرت از دو رنگ اصلی تولوئیدن بلو o و مالاشیت گرین تشکیل شده که رنگ های بازی با افینیتی بالا برای اجزای اسیدی مثل سیتوپلاسم هستند. pH رنگ آلبرت توسط استیک اسید حدود 2.8 تنظیم می‌شود که به نسبت pH گرانول‌های ولوتین بازی‌تر است (گرانول‌های ولوتین بسیار اسیدی هستند) بنابراین هنگامی که رنگ آلبرت به اسمیر افزوده می‌شود تولوییدن بلو گرانول‌های ولوتین را که اسیدی ترین بخش سلول هستند رنگ آمیزی میکند و مالاشیت گرین سیتوپلاسم را به رنگ سبز-آبی درمی‌آورد وجود ید در ترکیب رنگ آلبرت سبب می‌شود خاصیت متاکروماتیک ظاهر نشده و گرانول‌ها به رنگ آبی سیاه پدیدار شوند.
رنگ آلبرت از دو محلول رنگ آمیزی تشکیل شده است:
محلول ۱: محلول رنگ، شامل: تولوییدن بلو، مالاشیت گرین، glacial acetic acid و الکل
محلول۲: محلول mordant یا تثبیت کننده رنگ، شامل: ید و پتاسیم یدید محلول در آب
برای استفاده از رنگ آلبرت هردو محلول باید به صورت کارآمدی تهیه شده و محتوی درصد دقیقی از اجزا باشند تا گرانول‌های با رنگ صحیح بعد از رنگ آمیزی قابل رویت شوند. رنگ آلبرت تولید شرکت سیب زیست فن با توجه به نکات فوق و پس از تائید کنترل کیفی، تهیه و توزیع می‌شود
هدف از رنگ‌آمیزی آلبرت
رنگ آمیزی و مشاهده گرانول‌های متاکروماتیک کورینه باکتریوم دیفتریا*
*گرانول‌های متاکروماتیک در Yersinia pestis نیز یافت می‌شود
محدودیت رنگ‌آمیزی آلبرت
رنگ آلبرت صرفا جهت رنگ آمیزی اجسام کروماتیک ساخته شده و قادر به شناسایی سایر inclusion bodyها نیست.
شیوه رنگ‌آمیزی آلبرت
تجهیزات مورد نیاز
- تجهیزات حفاظت فردی (دستکش، روپوش آزمایشگاهی، محافظ چشم و غیره)
- اسلاید شیشه‌ای
- رک رنگ‌آمیزی
- رنگ آلبرت
- روغن ایمرسیون
- آب مقطر
- میکروسکوپ
مراحل رنگ‌آمیزی آلبرت
- ۱. یک لوپ از کشت کورینه باکتریوم تهیه کنید.
- ۲. اسمیری از آن را در مرکز لام شیشه ای تمیز ایجاد کنید
- ۳. اسمیر را به آرامی حرارت دهید تا فیکس شود
- ۴. اسلاید اسمیر را روی رک رنگ آمیزی قرار دهید
- ۵. از محلول یک به آن افزوده و 3-7 دقیقه زمان دهید
- ۶. اسمیر را به آرامی با آب شستشو دهید
- ۷.برای تثبیت، محلول دو را افزوده و 1-2 دقیقه صبر کنید
- ۸. لام ار به آرامی با آبکشی کنید.
- ۹. اجازه دهید اسلاید خشک شود
- ۱۰. 4) پس از افزودن روغن ایمرسیون، اسمیر را زیر میکروسکوپ با وضوح 1000 مشاهده کنید
نتایج و تفسیر رنگ‌آمیزی آلبرت
گرانول‌های متاکروماتیک آبی-سیاه به نظر میرسند در حالیکه بقیه سلول باکتری سبز خواهد بود. وجود گرانول‌های متاکروماتیک شاخصه باکتری کورینه باکتریوم دیفتریا است، رنگ آمیزی با رنگ آلبرت سبب رنگ پذیری این گرانول‌ها و ظهور نقاط آبی-سیاه گرد (round-shaped blue-black) در انتهای باسیل‌های سبزی است که به شکل حروف چینی یا به فرم L(L-shaped) یا V(V-shaped) هستند.